本文目录一览：
siRNA的筛选求教
1、首先需要针对目的基因设计高效的siRNA干扰片段。一般设计3-5条siRNA，然后对目的细胞进行转染，转染后24~72 h进行表达量检测，最佳检测时间与细胞类型、转染试剂、 检测 目的等相关。
2、shRNA的缺点是，体内很多基因功能互补，那么一个功能非常重要的基因可能有多种互补的途径，经过长期筛选，表型衰减甚至无表型；但成本低廉，而且可以得到稳定的模型。
3、另外，慢病毒一般都带筛选基因，可以考虑做稳定表达。如果只做瞬时表达，可考虑用转染试剂，成本、时间、方法都要省很多。
mRNA转染实验步骤
设置空白对照组，检验细胞生长状态。设置阴性对照组，无血清培养基 + Entranster-E 电转染试剂 + 阴性siRNA。
确定干扰靶点：通过基因组学凳厅袜、转录组学等手段，确定需要干扰的靶基因或RNA。合成siRNA：根据确定的干扰靶点，利用化学合成方法制备相应的siRNA。
（3）加入特定的荧光素酶底物转录因子是一种具有特殊结构，也称为反式作用因子。
提前1天细胞种植 悬浮细胞：采用对数生长期的细胞，数量为常规培养细胞数的1/3进行转染实验。如某细胞常规培养的细胞数是6×10^5，那么就用2×10^5的细胞进行转染。
可以先使用有荧光蛋白的空载体验证整个系统的转染效率，用流式检测就可以了，非常方便。确定转染效率没有问题后可以转染带有目的基因的质粒。对于转染效果的验证主要取决于你的目的蛋白的性质。主要是mRNA和蛋白水平的验证。
目的：掌握逆转录和半定量PCR的基本原理和操作过程。原理：逆转录的基本原理 提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。
悬浮细胞转染步骤及优化注意事项
1、慢病毒转染前18-24小时，将贴壁细胞以1×10^5/孔铺到24孔板中。使细胞在慢病毒转染时的数量为2×10^5/孔左右。第二天，用含有6 μg/ml polybrene的2ml新鲜培养基替换原培养基，加入适量病毒悬液。37℃孵育。
2、37°C培养48-72h，检测基因抑制效果。如果需要，细胞培养4-6h时可以更换培养基，但不是必须。孵育时间的长短，取决于细胞类型、所干扰基因本身及分析方法。可设置不同的孵育时间进行实验以确定最佳孵育时间。
3、转染步骤如下：试验准备：200ul/1mlTip头各一盒（以上物品均需高压灭菌），酒精棉球，废液缸，试管架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。弃掉培养皿中的培养基，用1ml的PBS溶液洗涤两次。
4、实验过程中，需避免RNA产品与人体皮肤或未经去RNA酶的实验耗材接触。因呼吸产生的气体和飞沫中均含有大量的RNA酶，所以必须佩戴口罩于超净工作台内进行实验操作。
5、如何去除转染后悬浮细胞中的死细胞 将培养瓶竖立放一段时间（50min左右），然后用吸管轻轻吸取上面1ml的细胞悬液，移入另一个新的已加培基的培养瓶中。
6、操作步骤：将转染试剂与目标分子（如质粒DNA、siRNA等）混合，形成载体-目标分子复合物。将该复合物加入包含目标细胞的培养基中，使其与细胞发生相互作用，从而导入目标分子。
原创文章，作者：两性健康知识网，如若转载，请注明出处：https://www.01088.com/lxwh/90216.html
