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探针设计在线-如何实现原位杂交之探针设计
原位杂交探针长度是100-400nt。用于原位杂交的探针可以是单链或双链DNA，也可以是RNA探针。通常探针操作的长度以100-400nt为宜，过长则杂交率减低。
在设计时，可依据图上三种指标的信息选取序列，如果觉得合适，可点击Tm图块上左下角的Upper按钮，选好上游引物，此时该按钮变成，表示上游引物已选取好。下游引物的选取步骤基本同上，只是按钮变成Lower。
杂交后处理 杂交完，以后的步骤不必要特意防RNA酶。弃去杂交液，载片浸入2xSSC中2×15 min。载片浸入1xSSC中55℃水浴摇动2×15 min。用含20mg/mL的RNaseA的NTE缓冲液37℃消化30分钟，以去除未结合的探针。
荧光原位杂交(FISH)实验操作步骤
1、）张切片加10μl～20μl DAPI，覆盖盖玻片并在室温下孵育2～5ml；2）尽可能快的在荧光显微镜下观察或封闭盒内保存在-20℃冰箱。切片在染色之后1h内可以在显微镜下观察。
2、荧光显微镜观察FISH结果 先在可见光源下找到具有细胞分裂相的视野，然后打开荧光激发光源，FITC的激发波长为490 nm。细胞被PI染成红色，而经FITC标记的探针所在的位置发出绿色荧光。
3、实验流程 FISH样本的制备→探针的制备→探针标记→杂交→(染色体显带)→荧光显微镜检测→结果分析。 特点 原位杂交的探针按标记分子类型分为放射性标记和非放射性标记。
4、操作步骤如下：(1)载片的清洁与处理载片的清洁很重要，特别不能有核酸酶的污染。为了在后续的杂交和冲洗等步骤中防止组织或细胞从载片上脱落，可以用多聚赖氨酸涂抹载片。
5、（1）20×SSC：173 g NaCl，82 g柠檬酸钠，加水至1 000 mL（用10 mol/L NaOH调pH 至0）。（2）去离子甲酰胺（DF）：将10 g混合床离子交换树脂加入100 mL甲酰胺中。
6、荧光原位杂交：以21号染色体的相应部位序列作探针，与外周血中的淋巴细胞或羊水细胞进行杂交，唐氏综合征患者的细胞中可呈现3个21号染色体的荧光信号。
简述原位杂交的步骤。
菌落原位杂交法氢氧化钠的作用是裂解细菌，菌落的原位杂交法的具体步骤：将分散再若干个平板上的少数菌落均匀点接到一个主平板上，并接上一个含有非重组质粒的转化子作对照，在37摄氏度下培养过夜，使菌落密度适中。
试验方法如下：1）玻片处理（a）玻片清洗：热肥皂水刷洗，1%盐酸浸泡24h，再在0.1%焦炭酸二乙酯（DEPC）中浸泡24h。（b）硅化处理：玻片和盖玻片1%（质量分数）盐酸煮沸10min，烘干，锡纸包好4℃保存备用。
浸入乙酸酐和三乙醇胺中以减低静电效应，减少探针对组织的非特异性背景染色。将组织切片浸入预杂交液中可达到封闭非特异性杂交点的目的，从而减低背景染色。预杂交液和杂交液的区别在于前者不含探针和dextran sulphate。
此步骤有助于除去非特异性结合的探针，从而降低本底。（1）杂交次日，将标本从37℃温箱中取出，用刀片轻轻将盖玻片揭掉。
以菌落原位杂交为例：对分散在若干个琼脂平板上的少数菌落（100-200）进行克隆筛选时，可采用该方法。将这些菌落归并到一个琼脂主平板以及已置于第二个琼脂平板表面的一张硝酸纤维素滤膜上。
原位杂交的例子
1、预杂交1）每个管中置换成大约300ulHYB－溶液，60℃水浴5分钟，避免振荡。2）用等体积的HYB+取代HYB－。3）60℃水浴，预杂交4小时以上。
2、原位杂交可以在细胞标本或组织标本上进行。其基本原理是两条核苷酸单链片段，在适宜的条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA、DNA-RNA或RNA-RNA双键分子的特点，应用带有标记的(有放射性同位素，如。
3、ISH是基于DNA/DNA或DNA/RNA双链的互补性，将标记的核酸探针原位杂交到目标上。通过这种方式，我们可以获得有用的空间信息。 FISH是检测微生物、诊断实体瘤和血液瘤以及指导癌症治疗的有效临床工具。
4、原位杂交：原位杂交：在研究DNA分子复制原理的基础上发展起来的一种技术。
原位杂交技术中有哪些步骤可以降低探针与RNA的非特异性结合?
1、由于杂交液较少，而且杂交温度较高，持续时间又长，因此为了保持标本的湿润状态，此过程在湿盒中进行。 洗脱 此步骤有助于除去非特异性结合的探针，从而降低本底。
2、试验方法如下：1）玻片处理（a）玻片清洗：热肥皂水刷洗，1%盐酸浸泡24h，再在0.1%焦炭酸二乙酯（DEPC）中浸泡24h。（b）硅化处理：玻片和盖玻片1%（质量分数）盐酸煮沸10min，烘干，锡纸包好4℃保存备用。
3、(1) 酶切DNA， 凝胶电泳分离各酶切片段，然后使DNA原位变性。(2) 将DNA片段转移到固体支持物(硝酸纤维素滤膜或尼龙膜)上。(3) 预杂交滤膜，掩盖滤膜上非特异性位点。(4) 让探针与同源DNA片段杂交，然后漂洗除去非特异性结合的探针。
4、该技术是指运用cRNA或寡核苷酸等探针检测细胞和组织内RNA表达的一种原位杂交技术。
5、而且，short-read RNA-Seq的数据质量也很好，在平台内和跨平台的稳定性也很高。尽管如此，在建库和分析的过程中还是会有一些问题。比如说，我们可能不能正确地鉴定和定量来自同一个基因的不同isoform。
6、原位杂交应用：细胞特异性mRNA转录的定位，可用于基因图谱，基因表达和基因组进化的研究。感染组织中病毒DNA/RNA的检测和定位，如EB病毒mRNA、人类乳头状瘤病毒和巨细胞病毒DNA的检测。
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